螢光放光光譜中的拉曼散射

什麼是拉曼散射？

　　當比色管(Cuvette)中的液態樣品受到激發光源的照射時，最多可能產生四種現象，最主要來自於樣品吸收之後的放光，也就是我們需要量測的光致螢光；光源沒有被樣品吸收，直接穿越；光源在樣品上發生彈性與非彈性碰撞，後者就是我們此篇要討論的拉曼散射。

　　在彈性碰撞的狀況，屬於雷利散射(Rayleigh)或根據粒子大小的米氏散射光，因為能量沒有損失，此時的放光與激發光相同，因此多半會出現在比放射光波長還短的位置。而在非彈性碰撞的狀況，激發光子可能從樣品中得到振動能量(Vibration energy)或是失去振動能量給樣品，也就是所謂的拉曼散射。拉曼散射光譜因為能量變化反應在波長的變化，使其有機會與螢光光譜重疊而影響量測結果。在固體樣品時，拉曼散射因為強度遠小於螢光光譜，幾乎不會造成影響。但是在液體樣品的量測，溶劑量會遠超過實際樣品的含量，使得溶劑的拉曼散射有機會大於樣品的放光而造成光譜量測的影響。

拉曼散射會造成什麼問題？

　　我們做一個實驗來說明，將螢光素(Fluorescein)溶解在PBS水溶液中，並以450奈米作為激發光源，可以發現在放射光譜訊號發生在532奈米的位置，如下圖所示。在這個實驗中，出現在532奈米的波峰，實際上是水受到450奈米波長激發所產生的拉曼散射並疊加在螢光素的主要波峰(512奈米)上。

如何分辨拉曼散射？

　　最簡單區分拉曼散射的方式是改變激發波長，由於光致螢光與拉曼散射的產生原理不同，光致螢光的放射光位置並不會受到激發光波長的影響，而拉曼散射是來自激發波長能量的變化，並且會正比於激發光的波長。在螢光素的例子中，我們改變激發波長在440奈米、450奈米與460奈米，可以發現拉曼散射的訊號也跟著改變，分別出現在518奈米、532奈米與546奈米。

如何去除拉曼散射？

　　知道如何分辨拉曼散射之後，我們只要控制激發光源，使拉曼散射避開我們需要量測的放射光譜波長範圍即可。但是此方法只適用於激發波長較廣的樣品，更有效的方式是以相同參數及同一個比色管分別量測樣品溶液與溶劑，將樣品溶液的光譜扣除溶劑的光譜，去除拉曼散射的干擾。Edinburgh Instrument在設計螢光光譜儀的時候，特別加裝一個參考偵測器，確認激發光源的狀況，消除因為使用時間與環境變化造成的影響，確保可以使用相同條件的激發光進行實驗。在上述的例子中，樣品溶液與PBS溶劑的放光光譜分別測量結果如下圖：

　　透過Edinburgh Instrument自行開發的Fluoracle軟體進行光譜扣除之後，可以得下圖純粹樣品本身的放光光譜。